Aleksandra Mirończuk
Rys. 1. Schemat fabryki mikrobiologicznej. Wykorzystując odpady, możemy produkować związki o wartości dodanej, takie jak słodziki, oleje mikrobiologiczne, enzymy i inne.
Początkowo biologia syntetyczna miała na celu tworzenie mikrobiologicznych fabryk komórkowych (ang. microbial cell factories), które umożliwiałyby tanią produkcję wartościowych dla człowieka związków chemicznych z surowców odpadowych. Z upływem lat, jak każda dziedzina nauki, ewoluowała, by obecnie skupiać się na wprowadzaniu nowych, sztucznych szlaków metabolicznych do komórek gospodarza i tworzeniu nowych, zmodyfikowanych systemów genetycznych. W kontrolowanych warunkach umożliwia to biosyntezę związków rzadkich, trudnych do uzyskania podczas syntezy chemicznej lub w celu obniżenia kosztów produkcji albo, co ostatnio jest również istotne, zachowania statusu procesu zrównoważonego rozwoju. Niezwykły potencjał fabryk mikrobiologicznych sprawił, że coraz więcej grup badawczych skupia uwagę na optymalizacji procesów syntezy związków istotnych dla człowieka. Jednym z podstawowych zagadnień biologii syntetycznej jest inżynieria metabolizmu komórkowego, czyli planowe zmienianie i modelowanie fizjologii komórki za pomocą nowych układów genetycznych. By móc tego dokonać, niezbędna jest znajomość genomu komórki gospodarza oraz posiadanie narzędzi molekularnych, które umożliwiają zmianę/edycję genomu według naszych potrzeb. Pierwszym ważnym elementem w biologii syntetycznej jest wybór gospodarza „mikrobiologicznej fabryki”. Często jest to bakteria Escherichia coli albo drożdże Saccharomyces cerevisiae, ponieważ jako modelowe mikroorganizmy o prostej budowie zostały doskonale przebadane, a wachlarz narzędzi do ich modyfikacji genetycznych jest szeroki, od wykorzystania szerokiej gamy promotorów, markerów selekcji czy technik oczyszczania białek (enzymów), które one produkują. Jednakże do produkcji wielu enzymów wykorzystuje się w biotechnologii również drożdże, takie jak Komagataella phaffii (znane dawniej pod nazwą Pichia pastoris) czy dimorficzne drożdże Yarrowia lipolytica. Te ostatnie mikroorganizmy są organizmami modelowymi do badania syntezy i akumulacji kwasów tłuszczowych w komórkach eukariotycznych, a ich dimorfizm polega na tym, że rosną w dwóch rodzajach komórek, o kształcie drożdżowym oraz w postaci filamentów, czyli pseudostrzępek, które mają kształt długich nitek. Dzięki nietypowym zdolnościom naturalnym, takim jak utylizacja hydrofobowych związków (np. tłuszczów czy związków ropopochodnych) oraz gromadzenie tłuszczów w swojej biomasie, stanowią cel badawczy wielu grup naukowych na świecie. Sekwencja ich genomu została opublikowana w 2005 roku i od tego czasu Y. lipolytica stała się nową fabryką komórkową do produkcji wielu cennych związków, np. kwasów tłuszczowych, które po procesie estryfikacji mogą stanowić materiał do produkcji mikrobiologicznego biopaliwa. Pomimo wielu zalet, drożdże te mają również wady, a jedną z nich jest wysokie zapotrzebowanie na rozpuszczony tlen (DO, ang. dissolved oxygen) w podłożu mikrobiologicznym. Bez niego drożdże słabo rosną a zdolność produkcyjna drastycznie spada, co sprawia, że przy przemysłowym zastosowaniu procesy stają się nieopłacalne finansowo. Co ważniejsze, przy niskim natlenieniu komórki Y. lipolytica zaczynają rosnąć w formie filamentów, a taka forma komórek ma niskie właściwości produkcyjne. Stanowi to poważny problem, ponieważ proces ustabilizowany na niewielkiej skali (kilku litrów) całkowicie zawodzi przy produkcji mającej objętość kilku metrów sześciennych płynu. Z pomocą przychodzi tutaj biologia syntetyczna oraz wykorzystanie inżynierii metabolizmu. By rozwiązać ten problem, do komórek drożdży wprowadziliśmy sztucznie zoptymalizowany, syntetyczny gen kodujący syntezę bakteryjnej hemoglobiny VHb, co umożliwiło aktywny wzrost zmodyfikowanych drożdży w środowisku o obniżonej zawartości DO. Jak to możliwe? Syntetyczny gen kodujący bakteryjną hemoglobinę VHb uległ ekspresji (został włączony), a wyprodukowane białko (hemoglobina) ułatwiło dyfuzję tlenu do wnętrza komórek, podkręcając ich metabolizm tlenowy. Dzięki temu komórki rosną tylko w postaci drożdżowej, nie tworząc filamentów, co przekłada się na ich wysoką zdolność produkcyjną np. erytrytolu, naturalnego słodzika, o zerowym indeksie glikemicznym.
Rys. 2. Drożdże Yarrowia lipolytica w warunkach obniżonej zawartości rozpuszczonego tlenu widziane pod mikroskopem. Lewy panel – komórki niezmodyfikowane, rosną w postaci strzępek; prawy panel – komórki poddane inżynierii metabolizmu rosną w postaci drożdżowej. (Mirończuk i inn. Microb Cell Fact, 18(1), 176)
Inną niezwykłą zaletą biologii syntetycznej jest to, że możemy tworzyć nieistniejące w przyrodzie fabryki komórkowe, np. zwiększać produkcję pożądanych enzymów (białek), tak jak naturalnie nigdy by nie powstały. Jest to możliwe za sprawą programowania zmian w promotorze, czyli regionie DNA znajdującym się bezpośrednio przed każdym genem, który jest odpowiedzialny za jego ekspresję, czyli docelowo produkcję białka. Obecnie jest możliwe zwiększanie aktywności promotorów, tak by były aktywne cały czas i nie ulegały „wyłączeniu” – w naturze nie jest to powszechne, ponieważ komórki, tak samo jak ludzie, nie lubią pracować bez potrzeby w nadmiarze. Mają mechanizmy kontrolujące promotory i ich aktywność, tak by niepotrzebnie nie tracić energii na produkcję zbędnych związków. Tu pojawia się mądrość matki natury, która jest oszczędna i nie lubi marnotrawstwa. Biologia syntetyczna umożliwiła zmianę promotorów na takie, które są permanentnie aktywne. Co więcej, można łączyć takie promotory z każdym innym genem, co sprawia, że możemy produkować białka w ilościach, które nie występują z naturalnymi promotorami. Dodatkowym atutem biologii syntetycznej jest tworzenie sztucznych promotorów, czyli takich, których w przyrodzie nie ma. Zmieniając ich sekwencję przez np. dodanie wzmacniaczy, powtórzenie wielokrotne danej sekwencji w regionie promotora sprawia, że działa on ze zwielokrotnioną siłą (nawet kilkaset razy) w porównaniu do promotorów naturalnych. Co więcej, możemy je również osłabiać, tak by utrzymywać geny na niskim, stałym poziomie ekspresji. Biologia syntetyczna dała nam możliwość układania systemów biologicznych niczym klocki Lego, układamy geny, promotory oraz terminatory transkrypcji (fragmenty DNA znajdujące się za genem) oraz miejsca ich dokowania w genomie, tak by osiągnąć najlepszy efekt. Czasami trzeba wyprodukować dużą ilość białka w krótkim okresie fermentacji, a niekiedy średni, lecz stały poziom biosyntezy jest bardziej pożądany w przemyśle. Białka są kodowane przez geny, które są zapisane w genomie za pomocą uniwersalnego kodu genetycznego, takiego samego dla każdego żyjącego organizmu na świecie, od bakterii, przez drzewa, do ludzi. Co ciekawe, każdy gatunek ma swoje preferencje, jeżeli chodzi o użycie uniwersalnych kodonów, kodujących aminokwasy (budulce białek), czyli białka mogą być zapisane troszeczkę inaczej, ale znaczyć to samo. Możemy to porównać do użycia różnej czcionki, słowa mają wtedy takie samo znaczenie, jednak litery nieco się różnią. Jest to niezwykle istotne w biologii syntetycznej, gdy chcemy produkować białka z jednego organizmu w innym. Dzięki temu, że znana jest sekwencja (zapis) kodująca białko, możemy zsyntetyzować sztuczne geny z przeprowadzoną optymalizacją kodonów, wskutek tego komórka gospodarza może dobrze „przeczytać” sekwencję, czyli przepisać z kodonu DNA na sekwencję aminokwasową w łańcuchu białkowym. Gdy używamy białek z bakterii czy grzybów strzępkowych, a chcemy je produkować w drożdżach, musimy ułatwić proces naszym fabrykom komórkowym.
Jednym z przykładów zastosowania takiego zabiegu jest wklonowanie genów kutynazy oraz PETazy do drożdży Y. lipolytica w celu biodegradacji tworzyw sztucznych, takich jak PET. Żadne z białek nie pochodzi z drożdży, kutynaza występuje w grzybach strzępkowych Fusarium solani pisi, natomiast PETaza w bakterii Ideonella sakaiensis. Zostały one wcześniej opisane jako enzymy, które mają zdolność rozkładu PET, plastiku, z którego są produkowane np. butelki na napoje. Niestety naturalna aktywność mikroorganizmów jest na tyle powolna, że praktycznie niewykrywalna, dopiero prace nad oczyszczonym enzymem udowodniły ten proces, niezwykle kosztowny, gdy stosuje się czysty enzym. W naszych badaniach połączyliśmy sztuczne geny z hybrydowym promotorem aktywnym w drożdżach Y. lipolytica, następnie takie konstrukty umieściliśmy w genomowym DNA drożdży. Aby wyprodukowane obce białko mogło opuścić komórkę, dodaliśmy do niego krótkie sekwencje sygnalne kierujące je na zewnątrz. Dodatkowo mikrobiologiczne fabryki drożdżowe pozbawiliśmy możliwości zniszczenia wyprodukowanych białek, usuwając w nich wcześniej zewnątrzkomórkowe proteazy. Proteazy, czyli enzymy, które tną na mniejsze fragmenty inne białka, przeznaczone do zniszczenia przez komórkę. Dzięki tym wszystkim zaplanowanym zabiegom zmieniliśmy metabolizm komórki w taki sposób, by kutynaza oraz PETaza były wydzielane do środowiska zewnętrznego w bardzo dużej ilości. Taki zabieg spowodował, że drożdże bez przerwy produkują enzymy, które mogą rozkładać tworzywa sztuczne, takie jak PCL (biodegradowalny plastik) albo PET (niebiodegradowalny plastik). Dzięki temu dodane do hodowli mikroorganizmów fragmenty folii czy proszku PET ulegały rozkładowi bez konieczności stosowania dodatkowych procesów, takich jak oczyszczanie białka, wstępnej obróbki plastiku czy wysokiej temperatury. Niezwykłość całego procesu polega na tym, że udało się przeprowadzić rozkład PET już w temperaturze 28oC, znacznie niższej od temperatury 70oC wymaganej przy zastosowaniu oczyszczonych enzymów. Osiągnięcia biologii syntetycznej umożliwiły zaprogramowanie metabolizmu komórek drożdży, zmieniając ich naturalną fizjologię. Drożdże stały się „pożeraczami plastiku”, ponieważ nie tylko rozkładają PET, ale również utylizują ich produkty rozkładu. PET, czyli poli(tereftelan etylenu), ulega całkowitej hydrolizie do glikolu etylowego (EG) oraz kwasu tereftalowego (TPA), a zmodyfikowane komórki drożdży Y. lipolytica mogą je wykorzystać do wzrostu, w wyniku tego naturalny obieg węgla w przyrodzie się zamyka. To sprawia, że nie tworzą się mikroplastiki, które mogłyby zanieczyszczać środowisko naturalne, tylko rosną drożdże, które składem chemicznym nie różnią się niczym od swoich niezmodyfikowanych pobratymców. Biomasa takich drożdży nie zawiera w sobie żadnych tworzyw sztucznych, ponieważ został on rozłożony „na czynniki pierwsze” i wprowadzony do naturalnego szlaku metabolicznego w komórkach drożdży.
Rys. 3. Folie PET inkubowane w płynnej hodowli drożdży Y. lipolytica; A – kontrola, drożdże niezmodyfikowane; B oraz C – drożdże poddane inżynierii metabolizmu. (Kosiorowska, 2023)
Innym przykładem możliwości zastosowania biologii syntetycznej jest zwiększenie naturalnych zdolności komórek drożdży Y. lipolytica do produkowania konkretnego związku (np. naturalnego słodzika erytrytolu) lub też wykorzystania jakiegoś nietypowego źródła węgla, czyli innego niż powszechnie używana glukoza. Glukoza jest uniwersalnym, lecz drogim substratem, dlatego też coraz częściej poszukuje się alternatywnych źródeł węgla i energii, by koszty produkcji były jak najniższe. Takimi źródłami węgla są odpady roślinne czy poprzemysłowe. Biomasa roślinna, najpowszechniejsze odnawialne źródło węgla, jest trudna do przetworzenia, ponieważ niewiele mikroorganizmów potrafi ją rozkładać, a powstające podczas chemicznej hydrolizy związki są bardzo często toksyczne dla mikroorganizmów. Biomasa alg morskich z powodu budowy ściany komórkowej jest o wiele łatwiejsza do rozłożenia przez mikroorganizmy, jednak oprócz glukozy i alginianu jej biomasa jest bogata w mannitol, naturalny poliol. Mannitol, podobnie jak erytrytol, jest również produkowany przez drożdże Y. lipolytica, jednak nie jest przez te drożdże wydajnie utylizowany. Co więcej, większość mikroorganizmów nie może go utylizować, czyniąc bezużytecznym substratem. Stosując biologię syntetyczną, udało się zmodyfikować szlak metaboliczny polioli w komórkach drożdży Y. lipolytica, wskutek tego mogą one rosnąć na mannitolu tak samo dobrze jak na drogiej glukozie. Dzięki przeprowadzonym wcześniej badaniom podstawowym udało się odnaleźć w tych drożdżach gen odpowiedzialny za represję (zahamowanie) utylizacji mannitolu. Po usunięciu tego genu okazało się, że fizjologia komórek uległa zmianie i drożdże mogą wykorzystać mannitol jako źródło węgla. Następnie, by móc w pełni wykorzystać mikrobiologiczną fabrykę, wprowadziliśmy nadekspresję genu aktywowanego sztucznym promotorem, który jest odpowiedzialny za przekierowanie metabolizmu komórkowego w stronę akumulacji lipidów. Dzięki temu udało się stworzyć fabrykę komórkową, która jest zasilana niedostępnym wcześniej, odnawialnym źródłem węgla i energii, produkującą lipidy, czyli kwasy tłuszczowe, które w dalszym procesie mogą być przeznaczone do produkcji „szytych na miarę” rzadkich związków lub biopaliwa.
Wykorzystując dokonania biologii syntetycznej, osiągamy cele, które dotychczas wydawały się nie do zdobycia. Stosując ją, być może zastąpimy olejami mikrobiologicznymi zmniejszające się pokłady paliw kopalnianych, zanieczyszczenie środowiska naturalnego zostanie zmniejszone dzięki aktywnemu wiązaniu CO2 przez zmodyfikowane mikroorganizmy, a zanieczyszczone mikroplastikami wody zostaną oczyszczone za pomocą produkowanych przez nie enzymów. Nie należy bać się GMM (genetycznie zmodyfikowanych mikroorganizmów), ale korzystać z postępów nauki, która w przyszłości ułatwi nam życie w świetle zwiększającej się ciągle ludzkiej populacji. Konsekwencją wydłużenia ludzkiego życia nie powinien być spadek jego jakości. Miejmy nadzieję, że osiągnięcia biologii syntetycznej umożliwią nam w przyszłości rozwiązanie i innych problemów, np. problemu chorób neurodegradacyjnych. Jednakże, aby do nich doszło, należy przeprowadzić wiele badań podstawowych, które wskażą, co należy naprawić, by rozwiązać problem.
Opisane powyżej badania były przeprowadzone w projektach OPUS14 UMO-2017/ 27/B/NZ9/02218, OPUS16 UMO-2018/31/B/NZ9/01025, SONATA BIS 7 UMO-2017/26/E/NZ9 /00975 oraz MINIATURA 2017/01/X/NZ9/01707 dzięki finansowaniu Narodowego Centrum Nauki.
Dr Aleksandra Mirończuk, Pracownia dla Zrównoważonego Biorozwoju, Instytut Biologii Środowiskowej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu
