Algorytm kontra nowotwór

Rysunek 1. Nowotwory będące przedmiotem badań w Zakładzie Onkologii Translacyjnej oraz w Centrum Analiz Biostatystycznych i Bioinformatycznych Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego.

Zespół Zakładu Onkologii Translacyjnej GUMed realizuje szereg projektów badawczych i badawczo-rozwojowych poświęconych płynnym biopsjom. W ten sposób włączamy się w globalny nurt badań, które mają szansę nie tylko pomóc lepiej zrozumieć biologię nowotworów, ale też poprawić proces diagnostyki.

Rysunek 2A. Przekrój przez naczynie krwionośne.

Rysunek 2B. Frakcje krwi dostępne w pobranej próbce.

Nowotwory stanowią drugą z najczęstszych przyczyn zgonów na świecie. Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia (ang. World Health Organization) z 2022 roku odnotowano 20 milionów nowych przypadków zachorowań, a prawie 10 milionów osób zmarło z tego powodu. Finansowanie leczenia onkologicznego i opieki paliatywnej w ramach powszechnego ubezpieczenia zdrowotnego w większości krajów jest niewystarczające. Międzynarodowa Agencja Badań nad Rakiem (ang. International Agency Research Cancer), wskazuje ponadto, że konsekwencje chorób nowotworowych dotykają w większym stopniu krajów słabiej rozwiniętych i zwraca uwagę na pilną potrzebę zajęcia się globalnymi nierównościami w tym zakresie.

W Polsce z chorobą nowotworową żyje prawie 1,2 miliona osób. Tylko w 2020 roku w Krajowym Rejestrze Nowotworów zanotowano 146 tysięcy nowych przypadków zachorowań i 100 tysięcy zgonów z tego powodu. Nowotwór złośliwy był przyczyną śmierci mniej więcej co piątej osoby, która zmarła tamtego roku.

Nowotwory stanowią istotny problem zdrowotny zwłaszcza w grupie wiekowej między 25 a 64 rokiem życia. Jest on szczególnie widoczny wśród kobiet – od kilku lat nowotwory złośliwe są główną przyczyną zgonów, do których dochodzi przed 65. rokiem życia (odpowiadają za 28,3% zgonów w tej grupie wiekowej), a w przypadku kobiet w średnim wieku (powyżej 40 roku życia) odpowiadają aż za 41,6% zgonów. Do najczęstszych lokalizacji kobiecych nowotworów należą piersi, a także narządy rodne – trzon macicy i jajniki [Rysunek 1]. Ten ostatni typ nowotworu jest szczególnie trudny w diagnostyce, a przez to niebezpieczny. Z uwagi na to, że nie daje początkowo żadnych charakterystycznych symptomów, pacjentki z reguły trafiają do właściwej kliniki w późnym (III lub IV) stadium jego rozwoju, kiedy skuteczne leczenie stanowi bardzo duże wyzwanie, a ryzyko nawrotów choroby wzrasta. W 2020 roku stwierdzono w naszym kraju prawie 5 tysięcy nowych zachorowań na raka jajnika, przy czym aż 70% przypadków wykryto w zaawansowanym stadium. W tym samym roku z powodu raka jajnika zmarło ponad 3 tysiące kobiet.

Kluczowe wyzwania, jakie stoją przed współczesną onkologią, to wczesne wykrywanie nowotworów i spersonalizowana opieka dostosowana do indywidualnych potrzeb pacjenta lub pacjentki. Setki akademickich laboratoriów i firm biotechnologicznych pracują więc nad nowymi metodami, które, po pierwsze umożliwią wykrycie we krwi niezwykle subtelnych sygnałów pozwalających na zdiagnozowanie nowotworu na bardzo wczesnym (dobrze rokującym) etapie, po drugie będą w czasie rzeczywistym dostarczać wiedzy o tym, jaka jest odpowiedź pacjenta lub pacjentki na wdrożone leczenie. Trudno wyobrazić sobie te prace bez wykorzystania algorytmów uczenia maszynowego, czyli sztucznej inteligencji. Dlaczego tak jest, wyjaśnimy na przykładzie jednej z procedur diagnostycznych – płynnej biopsji.

Czego nie potrafi człowiek?

Płynna biopsja to minimalnie inwazyjna alternatywa dla tradycyjnej biopsji, w przypadku której fragment guza do oceny pod mikroskopem pobiera się z reguły podczas operacji. Ostatnie znaczące osiągnięcia w dziedzinie płynnych biopsji mają ogromny wpływ na diagnostykę i leczenie nowotworów.

Płynna biopsja zwykle jest uzyskiwana poprzez pobranie próbki krwi lub innego płynu ustrojowego (np. moczu, płynu mózgowordzeniowego czy śliny). Procedura ta umożliwia analizę materiału pochodzącego z guza, ale w sposób niebezpośredni, na przykład w postaci krążącego DNA guza (ang. ctDNA, circulating tumor DNA – frakcja wolnokrążących kwasów nukleinowych), krążących komórek nowotworowych (ang. CTCs, circulating tumor cells), a ostatnio także płytek krwi, które zmieniają swój profil RNA pod wpływem toczącej się choroby nowotworowej [Rysunek 2]. Mała inwazyjność płynnej biopsji umożliwia wielokrotne pobieranie próbek (przed leczeniem, w trakcie, podczas remisji), co umożliwia stałe monitorowanie przebiegu choroby i odpowiedzi na leczenie.

Nowoczesne testy molekularne stanowią dowód na ogromny postęp, jaki dokonał się w ostatnich latach w zakresie pozyskiwania i analizy elementów płynów ustrojowych, tj. pojedynczych komórek, płytek krwi, DNA, RNA, białek czy biomarkerów metabolitów. Stosunkowo niedawno wprowadzono na rynek wysokowydajne techniki, które pozwalają na niespotykaną dotychczas rozdzielczość analiz, wkraczając tym samym na poziom tzw. multiomiki czy prowadzonych równolegle analiz różnego rodzaju biomateriałów. Trzeba jednak mieć świadomość, że ta złożoność i mnogość generowanych danych stwarza konieczność zastosowania zdecydowanie bardziej zaawansowanych podejść analitycznych niż założenie prostego punktu odcięcia dla interpretacji wyniku końcowego. W przypadku klasycznej morfologii, na podstawie zakresu liczby erytrocytów łatwo określić stan powyżej i poniżej normy. W przypadku testów molekularnych nie jest to takie proste. Z pewnością w nadchodzących latach będą one miały coraz większy wpływ na postępowanie terapeutyczne i opiekę nad pacjentami. Jednak zanim tak się stanie i płynne biopsje staną się standardowym narzędziem klinicznym, musimy nauczyć się prawidłowej interpretacji wyników tych badań i lepiej zrozumieć podłoże molekularne choroby nowotworowej. Właśnie te potrzeby niejako wymusiły na badaczach zastosowanie algorytmów uczenia maszynowego, zaprojektowanych do wykrywania niewielkich zmian na poziomie DNA, RNA, białek czy metabolitów. Sztuczna inteligencja, w przeciwieństwie do człowieka, może analizować setki tysięcy danych numerycznych jednocześnie, generując na koniec wynik zerojedynkowy [Rysunek 3].

Gdańskie badania nad płynną biopsją

Zespół Zakładu Onkologii Translacyjnej GUMed realizuje szereg projektów badawczych i badawczo-rozwojowych poświęconych płynnym biopsjom. W ten sposób włączamy się w globalny nurt badań, które mają szansę nie tylko pomóc lepiej zrozumieć biologię nowotworów (w naszych badaniach koncentrujemy się zwłaszcza na raku piersi i jajnika), ale też poprawić proces diagnostyki. Nasze podejście cechuje interdyscyplinarność, mamy wśród nas reprezentantów i reprezentantki: biologii molekularnej, onkologii, radiologii, ginekologii, patomorfologii, biostatystyki, bioinformatyki, sztucznej inteligencji, socjologii i psychoonkologii. Działalność Zakładu wspierana jest także przez Centrum Analiz Biostatystycznych i Bioinformatycznych Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego, zagraniczne jednostki naukowe, takie jak Uniwersytet w Utah czy University Medical Center w Amsterdamie, a także przedstawicieli biznesu z obszaru nowych technologii (Kainos Company). Takie kompleksowe podejście toruje drogę do przełomowych rozwiązań, wprowadzając jednocześnie innowacyjne koncepcje obliczeniowe i nowe standardy w medycynie opartej na sztucznej inteligencji.

Rysunek 3. Schemat postępowania z płynną biopsją. Po pobraniu krwi [1] próbka jest analizowana za pomocą technologii dostępnych w Zakładzie Onkologii Translacyjnej (mikroskop, cytometria obrazowa, sekwencjonowanie) [2]. Następnie wygenerowane dane porównywane są z próbkami referencyjnymi i publicznie dostępnymi repozytoriami danych – tutaj nakładany jest kontekst biologiczny poczynionych odkryć [3]. Ponieważ analiza gigabajtów danych przekracza możliwości człowieka, do pomocy angażowana jest sztuczna inteligencja umożliwiająca klasyfikację próbek w sposób zerojedynkowy [4]. Wynik wygenerowany przez sztuczną inteligencję w przyszłości będzie mógł wspierać lekarza w podejmowaniu decyzji, np. zmiany schematu leczenia, co stwarza podwaliny dla medycyny spersonalizowanej [5].

Aby wyjaśnić dlaczego, trzeba rozpocząć od kilku zdań na temat biologii nowotworów. Charakterystyczny dla rozwoju i progresji nowotworów jest proces tranzycji epitelialno-mezenchymalnej (ang. Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT), który zachodzi na poziomie komórkowym. W efekcie przemian biochemicznych komórki epitelialne (inaczej nabłonkowe, mało ruchliwe, o kolistym kształcie) są zdolne do tranzycji w komórki mezenchymalne (o bardziej wrzecionowatym kształcie, a co ważniejsze, o większej ruchliwości, zdolne do migracji do odległych części ciała).

W przypadku CellSearch® problemem jest to, że test ten opiera się na wstępnym wzbogaceniu komórek wykazujących ekspresję epitelialnych cząsteczek adhezyjnych (EpCAM), a następnie na barwieniu immunofluorescencyjnym przy użyciu odpowiednich markerów oraz na barwieniu jądrowym DAPI. Przyjęta przez CellSearch® definicja CTC, bazująca na markerach nabłonkowych (epitelialnych), nie jest dostatecznie precyzyjna i nie oddaje prawdziwej liczby krążących komórek nowotworowych, ponieważ wychwycenie frakcji mezenchymalnej za pomocą standardowych markerów stosowanych w CellSearch® jest niemożliwe. Dodatkowo niektóre CTC mogą być opłaszczone płytkami krwi. Wtedy prezentowane na ich powierzchni markery białkowe mogą być przysłonięte, co sprawia, że wychwycenie takich CTC staje się jeszcze większym wyzwaniem. Ostatecznie więc metoda, na której opiera się CellSearch®, jest dość ograniczona, ponieważ skupia się jedynie na subpopulacji komórek epitelialnych, nie daje zaś możliwości wykrycia subpopulacji komórek mezenchymalnych, tj. tych, które przeszły proces tranzycji epitelialno-mezenchymalnej (proces ten obniża bowiem ekspresję markerów epitelialnych) oraz tych opłaszczonych przez płytki. Dodatkowo warto zwrócić uwagę na to, że CellSearch® ma czułość wychwytywania tylko 1 CTC na 7,5 ml krwi, co ogranicza jego użycie, ponieważ osłabieni pacjenci onkologiczni nie mogą oddawać krwi w dużych ilościach.

Wiedząc o powyższych słabościach dostępnego na rynku testu, opracowaliśmy w Gdańsku metodę wzbogacania krążących komórek guza w celu uzyskania bardziej szczegółowej charakterystyki krążących komórek nowotworowych, która pozwala na izolację zarówno epitelialnej (nabłonkowej), jak i mezenchymalnej populacji. Jest to możliwe dzięki zastosowaniu w procesie wirowania specjalnego odczynnika, który pozwala na rozwarstwienie komórek krwi, a następnie użyciu kulek immunomagnetycznych do wyeliminowania z warstwy leukocytalnej komórek krwi (CD45+). Dzięki temu możliwe jest wyizolowanie i pozostawienie do analizy frakcji, w której krążących komórek nowotworowych jest proporcjonalnie więcej.

Sztuczna inteligencja w płynnej biopsji

Do wykrywania nabłonkowych CTC zastosowaliśmy cytokeratynę 19 (CK19), HER2 i mammaglobinę 1 (MGB1), a do wykrywania mezenchymalnych CTC wimentynę (VIM). Opracowana metoda została dodatkowo ulepszona dzięki dostępności nowoczesnej aparatury (cytometr przepływowy Amnis, system Parsortix oraz urządzenie Chroimum 10x Genomics) oraz wzbogacona o dodatkowy wychwyt tych krążących komórek nowotworowch, które są pokryte płytkami krwi. Nasz sukces nie byłby możliwy bez zastosowania algorytmów uczenia maszynowego, czyli sztucznej inteligencji.

Prace badawcze obejmujące analizę materiału z płynnych biopsji za pomocą sztucznej inteligencji rozpoczęły się w 2018 roku, w ramach finansowania z Narodowego Centrum Nauki uzyskanego przez dr Annę Supernat na realizację projektu „Analiza mutacji genów BRCA w odniesieniu do profilu transkryptomicznego płytek krwi u chorych na raka jajnika” (Miniatura, 2018/02/X/NZ5/01408). Dzięki współpracy z Kliniką Ginekologii Onkologicznej Uniwersyteckiego Centrum Klinicznego w Gdańsku udało się zgromadzić płynne biopsje od ponad 100 chorych z podejrzeniem raka jajnika. Dzięki kolejnym środkom pozyskanym z NCN (projekt „Analiza interakcji pomiędzy płytkami krwi edukowanymi przez nowotwór a komórkami raka jajnika”, SONATA, 2018/31/D/NZ5/01263), obok dalszego biobankowania materiału pozyskanego od chorych udało się zoptymalizować hodowle in vitro linii komórkowych, których celem było zbadanie interakcji pomiędzy płytkami krwi i komórkami raka jajnika.

Opracowany wcześniej warsztat badawczy posłużył jako baza do kolejnych badań, w których tym razem skupiliśmy się na potrójnie ujemnym raku piersi. Projektem „Badanie progresji potrójnie ujemnego raka piersi – analiza krwi w oparciu o sekwencjonowanie pojedynczych komórek i metody sztucznej inteligencji” (dofinansowanie NCN w ramach programu OPUS, 2020/37/B/NZ7/02069) kieruje prof. Anna Żaczek. W trakcie projektu prace na materiale klinicznym uzupełniane są o badania in vitro.

Szczególnie interesuje nas aspekt krążących komórek nowotworowych i komórek towarzyszących komórkom nowotworowym, takim jak neutrofile i płytki krwi. Badania skupią się na zawartości RNA pojedynczych komórek, a więc rozdzielczości, która do tej pory była nieosiągalna w świecie biologii molekularnej (jak dotąd sekwencjonowaniu podlegała cała próbka krwi, a nie wybrane komórki). Technologia ta pozwala nam się przyjrzeć patologiom w poszczególnych komórkach – CTC, monocytach, neutrofilach – a nie ich mieszaninie. Tak więc obok analizy poszczególnych typów komórkowych, możemy też uwzględnić w analizie zmienność komórek reprezentujących tę samą subpopulację komórkową. Tak czułe, innowacyjne i wysokoprzepustowe technologie molekularne muszą być uzupełnione analizą opartą na uczeniu maszynowym. Podejście to może pomóc m.in. w wyjaśnieniu biologii leżącej u podstaw interakcji komórek krwi w tzw. potrójnie ujemnym raku piersi, który charakteryzuje się agresywnym przebiegiem i najgorszym rokowaniem spośród wszystkich podtypów raka piersi (stanowi obecnie 15-20% przypadków).

Projekt jest realizowany przez Laboratorium Onkologii Translacyjnej GUMed w ścisłej współpracy z Wydziałem Nauk Klinicznych (Uniwersytet w Bergen, Norwegia) oraz Centrum Nauki i Inżynierii BioSystems (Indyjski Instytut Nauki, Bangalore, Indie). Dodatkowego wsparcia, dzieląc się doświadczeniami i dobrymi praktykami, udzielają nam dwie kolejne wysokospecjalistyczne jednostki: Breast Unit (Uniwersyteckie Centrum Kliniczne w Gdańsku) oraz Centrum Nowotworów (Wolny Uniwersytet, Amsterdam).

Obok projektów czysto badawczych w Zakładzie Onkologii Translacyjnej realizowany jest również projekt badawczo-rozwojowy „Wykorzystanie sekwencjonowania pojedynczych krążących komórek guza do analizy płynnych biopsji u chorych na raka jajnika” (NCBR, program LIDER 0059/L-11/2019), którym kieruje dr Anna Supernat. Jego celem jest przyspieszenie diagnostyki raka jajnika na podstawie materiału płynnej biopsji i uczenia maszynowego. Dokonaliśmy już dwóch zgłoszeń patentowych na wynalazki, które w przyszłości mogą stanowić podstawę testów diagnostycznych służących do wczesnego wykrywania nowotworów. Trzon zespołu projektowego stanowią w tym przypadku bioinformatycy, biostatystycy i specjaliści ds. sztucznej inteligencji, choć w prace mocno zaangażowane są także badaczki z Pracowni Analiz Pojedynczych Komórek Instytutu Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu. Bez ich udziału sekwencjonowanie pojedynczych komórek nie byłoby możliwe.

Jakie to ma znaczenie?

Nasze badania traktujemy jako kolejny krok w kierunku spersonalizowanej medycyny. Analiza płynnych biopsji pobieranych przy każdej wizycie pacjentki w klinice umożliwi dynamiczne śledzenie przebiegu choroby nowotworowej, a wykorzystanie najnowszych osiągnięć technologicznych zaowocuje szybszą i dokładniejszą analizą tego typu materiału. W dłuższej perspektywie przełoży się to na optymalny dobór leczenia, a tym samym obniżenie śmiertelności chorych onkologicznych oraz zwiększenie ich komfortu życia podczas terapii. Efekty naszych prac mogą się również okazać przydatne dla prowadzących badania nad innymi rodzajami nowotworów.