logo
FA 4/2024 z laboratoriów

Grzegorz Chodaczek

Limfocyty T gamma-delta niszczą nowotwory

Immunoterapia, w przeciwieństwie do chemio– i radioterapii, jest precyzyjnie ukierunkowana na nowotwór, dzięki czemu oszczędza zdrowe komórki i daje mniejsze ryzyko wystąpienia działań niepożądanych. Ma ona też potencjał do długotrwałego wpływu na układ odpornościowy i mniejszej oporności, poprawiając wskaźniki przeżywalności.

Choroba nowotworowa stanowi drugą, po chorobach układu krążenia, najczęstszą przyczynę zgonów w państwach Unii Europejskiej. Co roku diagnozuje się ją u około 2,6 miliona osób, a około 1,2 miliona ludzi umiera z jej powodu. Niewystarczająca skuteczność chemio– i radioterapii, będących obok chirurgicznej resekcji nowotworu podstawowymi formami leczenia, była motorem do wykorzystania potencjału układu odpornościowego do walki z rakiem. Układ ten tworzony jest przez różnego typu komórki, które kontrolują homeostazę organizmu i są zdolne do migracji oraz wnikania w mikrośrodowisko tkanki nowotworowej, gdzie przy odpowiedniej aktywacji mogą niszczyć nieprawidłowe komórki. Niestety oprócz komórek nowotworowych w mikrośrodowisku guza występują fibroblasty, różnego typu odpornościowe komórki supresorowe, nowo wytworzone naczynia krwionośne i pozakomórkowa macierz, które łącznie wywołują efekt immunosupresyjny, wspierając rozwój guza oraz tworzenie przerzutów do innych organów. Odkrycie pronowotworowej roli mikrośrodowiska doprowadziło do powstania nowego sposobu leczenia – immunoterapii, która polega na modyfikacji funkcji mikrośrodowiska i komórek układu odpornościowego pacjenta w celu hamowania rozwoju nowotworów oraz lepszego rozpoznawania i niszczenia komórek nowotworowych. Immunoterapia, w przeciwieństwie do chemio– i radioterapii, jest precyzyjnie ukierunkowana na nowotwór, dzięki czemu oszczędza zdrowe komórki i daje mniejsze ryzyko wystąpienia działań niepożądanych. Ma ona też potencjał do długotrwałego wpływu na układ odpornościowy i mniejszej oporności, poprawiając wskaźniki przeżywalności. Immunoterapię stosuje się jednak razem z konwencjonalnymi formami leczenia, gdyż ma ona również swoje ograniczenia.

Aktualnie najczęściej stosowanym podejściem immunoterapeutycznym jest leczenie inhibitorami tzw. immunologicznego punktu kontrolnego (IPK), czyli przeciwciałami monoklonalnymi, które blokują białka będące „hamulcami” w układzie odpornościowym. Białka te przeciwdziałają nadmiernej aktywacji komórek immunologicznych, ale jednocześnie osłabiają ich naturalną odpowiedź przeciwnowotworową. Poprzez zahamowanie funkcji IPK aktywacja układu odpornościowego w obrębie mikrośrodowiska jest podtrzymana, a reakcje przeciwnowotworowe wzmocnione, co prowadzi do aktywnego niszczenia nowotworów np. przez limfocyty T. Jednym z pierwszych leków tego typu było przeciwciało monoklonalne pembrolizumab, skierowane przeciwko receptorowi programowanej śmierci komórki 1 (ang. programmed death receptor 1, PD-1). Blokada białka PD-1 przeciwdziała tzw. „wyczerpaniu” cytotoksycznych limfocytów T i wydłuża ich aktywność przeciwnowotworową. W immunoterapii wykorzystuje się również bewacyzumab – przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (ang. vascular endothelial growth factor, VEGF). Zahamowanie funkcji VEGF w obrębie guza ogranicza wzrost naczyń krwionośnych dostarczających mu substancje odżywcze, a w konsekwencji spowalnia jego rozwój. Testowane są także przeciwciała swoiste wobec zidentyfikowanych fragmentów białek (antygenów) nowotworowych, które po związaniu się do komórek zawierających te antygeny na swojej powierzchni aktywują mechanizmy odporności wrodzonej, indukując tzw. cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał. Ponadto eksperymentalna immunoterapia nowotworów obejmuje również szczepionki zawierające peptydy izolowane z nowotworów prezentowane przez komórki dendrytyczne w celu wytworzenia odpowiedzi immunologicznej opartej na przeciwciałach i cytotoksycznych komórkach efektorowych.

Limfocyty T gamma-delta niszczą nowotwory 1

Analiza efektu cytotoksycznego limfocytów T γδ wobec komórek GBM w ciągu 12 h hodowli mieszanej wyrażona spadkiem powierzchni warstwy GBM.

Limfocyty T γδ mogą działać szybciej

Dzięki rozwojowi technik inżynierii genetycznej powstała przeciwnowotworowa terapia komórkowa CAR-T, bazująca na genetycznej modyfikacji komórek T pobranych od pacjenta onkologicznego poprzez wprowadzenie do nich tzw. chimerycznych receptorów antygenowych (ang. chimeric antigen receptor, CAR). Receptory CAR, podobnie do przeciwciał swoistych wobec peptydów produkowanych przez dany nowotwór, rozpoznają komórki z określonymi sekwencjami peptydowymi w białkach błonowych i aktywują ścieżki sygnałowe w zmodyfikowanych limfocytach T, prowadząc do uruchomienia funkcji cytotoksycznych i niszczenia komórek nowotworowych. W następnym kroku komórki CAR-T hoduje się i namnaża w warunkach in vitro, po czym podaje się je z powrotem pacjentowi. Migrują one wówczas po całym organizmie pacjenta, a po rozpoznaniu komórki nowotworowej powodują jej śmierć. Jak dotąd komórki CAR-T wykazują największą aktywność wobec rozsianych komórek białaczkowych, które nie tworzą mikrośrodowiska. W przypadku guzów litych, ich immunosupresyjne mikrośrodowisko niestety znacząco osłabia skuteczność terapii CAR-T.

Dalsze ulepszenia przeciwnowotworowych terapii komórkowych obejmują tworzenie bardziej wydajnych receptorów CAR, a także identyfikację lepszych komórek efektorowych do podania pacjentowi. W tym drugim przypadku obiecującym kandydatem są limfocyty T wykazujące ekspresję receptora komórek T (ang. T cell receptor, TCR) zbudowanego z łańcuchów γ i δ, którym nasza grupa interesuje się od dawna. Limfocyty T γδ stanowią 1-10% limfocytów T krążących we krwi i mają cechy zarówno wrodzonego, jak i nabytego układu odpornościowego. Ta właściwość czyni je bardziej odpowiednimi do terapii komórkowych niż dominujące we krwi limfocyty T z łańcuchami α i β, które stanowią naszą główną broń w odpowiedzi przeciwzakaźnej, ale również standardowo są wykorzystywane do terapii CAR-T. Kompleks białkowy αβ TCR, jako główny receptor limfocytów T αβ, odpowiadający za rozpoznawanie patogenów i aktywację funkcji efektorowych w komórkach T αβ, wymaga przetworzenia białek charakterystycznych dla danego patogenu do krótkich sekwencji peptydowych i ich prezentacji przez obecne w błonie komórek cząsteczki głównego układu zgodności tkankowej (ang. major histocompatibility complex, MHC), dopiero interakcja αβ TCR z antygenem/peptydem związanym z MHC prowadzi do niszczenia zakażonej komórki. W przypadku receptora γδ TCR uważa się, że rozpoznaje on bezpośrednio tzw. antygeny stresu komórkowego (pojawiające się np. w zakażonych lub zmienionych nowotworowo komórkach), bez potrzeby kompleksu MHC, dzięki czemu limfocyty T γδ mogą działać szybciej niż limfocyty T αβ. Co ważne, niewrażliwość na obecność cząsteczek MHC, których rodzaj jest zmienny osobniczo, umożliwia allogeniczne terapie komórkowe – od niespokrewnionych dawców – w sytuacjach, gdy ekspansja pobranych limfocytów T i ich powrotny transfer do tego samego pacjenta stają się utrudnione lub niemożliwe. Ponadto po aktywacji limfocyty T γδ wytwarzają interferon γ (IFN-γ) i czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α), białka z grupy cytokin wykazujące działanie przeciwnowotworowe.

Biologia limfocytów T γδ jest jednak nadal nie do końca poznana, co spowalnia ich translację do zastosowań klinicznych. Tożsamość czynników (ligandów) rozpoznawanych przez γδ TCR i mechanizmy ich wiązania przez γδ TCR, prowadzące do aktywacji komórek, są obecnie przedmiotem intensywnych badań. Wykazano jak dotąd, że komórki T γδ z łańcuchem δ typu Vδ2 (Vδ2+), obecnym w większości limfocytów T γδ we krwi, reagują na fosfo-antygeny, które są niepeptydowymi fosforylowanymi związkami szlaków biosyntezy izoprenoidów. Inna duża subpopulacja limfocytów T γδ z łańcuchem δ typu Vδ1 (Vδ1+), występująca głównie w skórze i błonach śluzowych, rozpoznaje cząsteczki ulegające ekspresji na komórkach poddanych stresowi i transformacji nowotworowej (np. białka MICA/B i UL16BP). Co więcej, obie populacje komórek T γδ wykazują ekspresję białka NKG2D, które również wiąże się z antygenami stresu komórkowego i może skutecznie wyzwalać funkcje cytotoksyczne limfocytów T γδ.

Mysz z ludzkimi komórkami

Potencjał przeciwnowotworowy limfocytów T γδ oraz wiedza o tym, jak je aktywować i namnażać in vitro, doprowadziły do prób wykorzystania ich w terapii nowotworów. Zadanie to wymaga przede wszystkim innowacyjnych modeli doświadczalnych umożliwiających testowanie nowych strategii terapeutycznych w warunkach jak najlepiej naśladujących organizm ludzki. Standardowym podejściem były początkowo badania in vitro sprawdzające wpływ analizowanych substancji na jednorodne, jednowarstwowe hodowle linii komórek nowotworowych, bez udziału wieloskładnikowego mikrośrodowiska guzów. Modele in vitro są jednak wciąż udoskonalane, czego przykładem są hodowle nowotworowe trójwymiarowe (3D), np. w postaci kulistych, wielokomórkowych agregatów, tzw. sferoidów, które odwzorowują strukturę i zróżnicowanie funkcjonalne między komórkami znajdującymi się wewnątrz i na zewnątrz guza. Jeszcze wyższy poziom złożoności, zachowujący heterogeniczność i architekturę tkanki nowotworowej, oferują tzw. organoidy, czyli fragmenty guza zawierające mikrośrodowisko, pobrane od pacjenta i hodowane przez krótki czas w specjalnych pożywkach. Mają one jednak dużo ograniczeń i nie oddają w pełni warunków in vivo. Dlatego też doświadczenia na zwierzętach laboratoryjnych są wciąż najistotniejszym etapem badań przedklinicznych w onkologii, zanim nowa terapia będzie przetestowana na ludziach. Popularnym modelem tej fazy są myszy laboratoryjne z upośledzonym systemem immunologicznym, umożliwiające ksenotransplantacje, czyli wszczepianie komórek lub tkanek nowotworowych pochodzących od ludzi do innych organizmów. Myszy takie nie odrzucają implantowanych komórek nowotworowych, dzięki czemu możliwa jest analiza wzrostu samego nowotworu oraz testowanie wpływu terapii na jego rozwój, bez zakłóceń wynikających z obecności mysiego układu odpornościowego. Rozwój immunoterapii wskazuje jednak, że o powodzeniu leczenia decyduje również aktywność komórek towarzyszących nowotworowi, co mocno osłabia znaczenie badań na mysich modelach, w których indukuje się guzy bez ludzkiego mikrośrodowiska.

Postęp w dziedzinie modelowania chorób doprowadził do powstania udoskonalonego modelu zwierzęcego, tzw. myszy humanizowanej, która może stanowić rzeczywisty awatar pacjenta onkologicznego. W istocie jest to mysz laboratoryjna, do której wszczepiono ludzkie krwiotwórcze komórki macierzyste (ang. hematopoietic stem cells, HSC), będące prekursorami różnych linii komórek odpornościowych. W organizmie myszy powstaje wówczas funkcjonalny układ odpornościowy człowieka, pozwalający na badania szerokiego zakresu chorób, w tym raka, chorób zakaźnych i autoimmunologicznych. Co istotne, zaimplantowane komórki nowotworowe w humanizowanej myszy tworzą guz wraz z mikrośrodowiskiem, naciekanym przez różne ludzkie komórki układu odpornościowego o działaniu osłabiającym reakcje przeciwnowotworowe, tak jak dzieje się to w przebiegu faktycznej choroby u pacjenta. Model ten umożliwia analizę interakcji między komórkami nowotworowymi a układem odpornościowym, ocenę skuteczności immunoterapii oraz identyfikację potencjalnych biomarkerów odpowiedzi na terapię.

Limfocyty T gamma-delta niszczą nowotwory 2

Wizualizacja aktywacji limfocytów T γδ w kontakcie z nowotworem GBM za pomocą immunofluorescencji i mikroskopii konfokalnej.

W laboratorium Grupy Badawczej Immunoterapii w Sieci Badawczej Łukasiewicz – PORT Polskim Ośrodku Rozwoju Technologii koncentrujemy się na opracowaniu modeli badawczych służących ocenie użyteczności stosowania komórek T γδ do terapii przeciwnowotworowych. Wiele opublikowanych danych uzyskanych doświadczalnie na myszach laboratoryjnych wskazuje na skuteczność limfocytów T γδ w niszczeniu różnego typu nowotworów. Szczególnie interesujący jest przykład wykorzystania tych komórek w terapii glejaków, których leczenie jest wyjątkowo trudne. Glejaki to najczęstsze nowotwory złośliwe mózgu u dorosłych, wywodzące się z komórek glejowych, które wspierają funkcjonowanie i strukturę układu nerwowego. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) wyróżnia kilka typów glejaka na podstawie ich pochodzenia: gwiaździak (astrocyty), skąpodrzewiak (oligodendrocyty), wyściółczak (komórki ependymalne). W zależności od agresywności glejaki dzieli się na cztery stopnie (I–IV), od niskiej do wysokiej złośliwości. Glejak wielopostaciowy (glioblastoma multiforme, GBM, gwiaździak IV stopnia wg WHO) to najbardziej agresywny nowotwór mózgu, który stanowi 54% wszystkich glejaków i 16% wszystkich pierwotnych guzów mózgu. Zapadalność na GBM wynosi 2-3 na 100 tys. osób, a wskaźniki przeżycia rocznego i 5-letniego są bardzo niskie i wynoszą odpowiednio 37,2% i 5,1%. Obecne leczenie opiera się na chirurgicznej resekcji guza i następczej radioterapii oraz uzupełniającej chemioterapii z wykorzystaniem temozolomidu. Niestety z powodu niecałkowitego usunięcia komórek nowotworowych i lekooporności w ponad 90% przypadków guzy nawracają, co pokazuje, że opracowanie alternatywnych podejść terapeutycznych do glejaka wielopostaciowego jest konieczne. W kontekście eksperymentalnej (przedklinicznej) immunoterapii GBM opierającej się na komórkach T γδ (typu Vδ2+) wykazano, że mają one zdolność do hamowania wzrostu guza i znacząco wydłużają przeżycie myszy z zaimplantowanymi do mózgu komórkami nowotworowymi. Wyniki te potwierdza toczące się badanie kliniczne (ClinicalTrials.gov ID: NCT04165941), w którym planowane jest testowanie genetycznie zmodyfikowanych limfocytów T γδ, niewrażliwych na temozolomid, tak aby były one oporne na równolegle stosowaną chemioterapię.

Odtworzyć układ odpornościowy pacjenta w organizmie myszy

W naszych badaniach, objętych zgodą Komisji Bioetycznej, wykonujemy testy porównawcze funkcji limfocytów Vδ1+ i Vδ2+ wobec GBM w celu wykazania, która z tych dwóch populacji limfocytów ma większą skuteczność w walce z glejakiem. Dzięki współpracy z Regionalnym Centrum Krwiodawstwa i Krwiolecznictwa we Wrocławiu pozyskujemy kożuszki leukocytarne, z których izolujemy jednojądrzaste komórki krwi obwodowej jako materiał wyjściowy do założenia hodowli limfocytów T γδ. Standardowo prowadzimy trzytygodniowe hodowle, stosując opisane w literaturze naukowej protokoły ekspansji komórek, dedykowane dla danego typu limfocytów. Równolegle tworzymy też dwu– i trójwymiarowe hodowle komórek nowotworowych w oparciu o ustalone linie komórkowe glejaka i pierwotny materiał kliniczny: fragmenty guzów mózgu po resekcji, uzyskane z lokalnych szpitalnych oddziałów neurochirurgicznych. Aktywność cytotoksyczną limfocytów T γδ względem komórek nowotworowych oceniamy w hodowlach mieszanych obu populacji komórek, stosując różne badania żywotności komórek (m.in. test enzymatyczny oparty o enzym dehydrogenazę mleczanową uwalnianą do medium hodowlanego przez zabijane komórki) oraz za pomocą przyżyciowego obrazowania mikroskopowego wizualizującego proces niszczenia komórek glejaka przez limfocyty T γδ. Dodatkowo, wykonując analizy immunofluorescencyjne, określamy wpływ terapii na indukcję apoptozy prowadzącej do śmierci komórek nowotworowych (pomiar aktywacji kaspazy-3) i na zdolność komórek glejaka do dalszych podziałów komórkowych (marker proliferacji Ki67), a także mierzymy cytokiny wydzielane przez limfocyty, świadczące o ich aktywności przeciwnowotworowej. Wykorzystując skaningowo-transmisyjną mikroskopię elektronową (SEM/STEM) w celu wizualizacji ultrastruktury synapsy immunologicznej tworzonej przez limfocyty reagujące z komórkami nowotworowymi, chcemy określić mechanizm ich działania – synapsa jest miejscem uwalniania ziarnistości cytotoksycznych, które nieodwracalnie uszkadzają błonę komórkową nowotworów. Jak dotąd nasze jeszcze niepublikowane dane wskazują, że oba typy komórek T γδ są w stanie niszczyć komórki GBM, ale ich skuteczność różni się w zależności od rodzaju komórek nowotworowych, protokołu ekspansji, a także od dawcy limfocytów T γδ.

Limfocyty T gamma-delta niszczą nowotwory 3

Wizualizacja ultrastruktury limfocytów T γδ w kontakcie z nowotworem GBM za pomocą mikroskopii elektronowej SEM/STEM i techniki FIB.

Wyniki te weryfikować będziemy w modelu in vivo, docelowo w myszy humanizowanej, będącej awatarem pacjenta z glejakiem (za zgodą Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach). Opublikowane badania dotyczące funkcji cytotoksycznych limfocytów T γδ (Vδ2+) wobec komórek GBM opierają się na myszach z niedoborem odporności, w których rozwijający się guz nie zawiera ludzkiego mikrośrodowiska odpowiedzialnego za lokalną immunosupresję, potencjalnie negatywnie wpływającą na komórki T γδ. Dysponując komórkami HSC pacjenta, planujemy odtworzyć jego układ odpornościowy w organizmie myszy, tak by komórki nowotworowe implantowane do mózgu myszy wytworzyły immunosupresyjne mikrośrodowisko zbliżone do sytuacji klinicznej. Ocena działania limfocytów T γδ będzie wówczas bardziej wiarygodna. Model awatara pacjenta onkologicznego to krok na drodze rozwoju medycyny spersonalizowanej: przeszczep komórek nowotworowych pacjenta do myszy humanizowanych jego własnymi komórkami odpornościowymi pozwoli na testy różnych metod terapeutycznych i określenie najlepszej strategii leczenia dla danej osoby. W efekcie może to prowadzić do bardziej indywidualnych i skuteczniejszych schematów leczenia.

Porównanie aktywności komórek Vδ1+ i Vδ2+ dostarczy cennych informacji na temat mechanizmów aktywacji limfocytów T γδ i działania na GBM, co w przyszłości może doprowadzić do dalszych badań rozwojowych uwzględniających modyfikację genetyczną komórek w celu poprawy ich funkcji i umożliwiających translację do zastosowań klinicznych. Aktualnie wiele firm farmaceutycznych o światowym zasięgu (m.in. Acepodia, Adaptate Therapeutics, Adicet, Cytomed Therapeutics, Gadeta, Immatics, IN8bio, Kiromic Biopharma, Lava Therapeutics, Takeda Pharmaceuticals, TC Biopharm) aktywnie realizuje pomysł wykorzystania limfocytów T γδ w allogenicznej terapii nowotworów jako gotowego leku (ang. off-the-shelf), włączając również wprowadzanie do nich receptorów CAR. Wg bazy ClinicalTrials.gov istnieje aktualnie 9 zarejestrowanych badań klinicznych opartych głównie na komórkach Vδ2+. Wizja translacji naszych wyników na komercyjnie dostępny produkt terapeutyczny jest bardzo atrakcyjna, aczkolwiek rozwój jakiejkolwiek wysokospecjalistycznej terapii komórkowej wymaga połączenia głębokiej wiedzy naukowej, różnorodnych kompetencji i znacznych zasobów finansowych. Nowoczesne, innowacyjne terapie przeciwnowotworowe powstają zwykle w ścisłej współpracy ośrodków badawczych, małych i średnich przedsiębiorstw oraz dużych koncernów farmaceutycznych. Wszystko jednak zawsze zaczyna się od badań podstawowych, bez których nie ma badań aplikacyjnych i ewentualnych wdrożeń.

Badania finansowane przez Narodowe Centrum Nauki w ramach konkursu OPUS-18: 2019/35/B/NZ6/03748 pt.: „Analiza skuteczności immunoterapii glejaka z wykorzystaniem limfocytów T gamma-delta”.

Dr hab. Grzegorz Chodaczek, lider Grupy Badawczej Immunoterapii, Centrum Nauk o Życiu i Biotechnologii, Sieć Badawcza Łukasiewicz – PORT Polski Ośrodek Rozwoju Technologii

Wróć